土壤微生物的知識

　　土壤微生物篇一：土壤微生物的採集一般有土樣採集

土壤微生物的採集一般有土樣採集、增殖培養、培養分離、篩選最後進行純種分離、毒性試驗等。

1、採樣：

一般在有機質較多的肥沃土壤中，微生物的數量最多，中性偏鹼的土壤以細菌和放線菌為主，酸性紅土壤及森林土壤中黴菌較多，果園、菜園和野果生長區等富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和黴菌較多。選擇一定的土壤環境採集土樣，將採集到的土樣盛入清潔的聚乙烯袋、牛皮袋或玻璃瓶中。

2、增殖培養：

為了容易分離到所需的菌種,讓無關的微生物至少是在數量上不要增加,可以通過配製選擇性培養基,選擇一定的培養條件來控制.例如碳源利用的控制,可選定糖,澱粉,纖維素,或者石油等,以其中的一種為唯一碳源,那麼只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長,而其它微生物就可能死亡或淘汰.這樣對下階段的純種分離就會順利得多.

3、培養分離：

儘管通過增殖培養效果顯著,但還是處於微生物的混雜生長狀態.因此還必須分離,純化.在這—步,增殖培養的選擇性控制條件還應進一步應用,而且控制得細一點,好一點.純種分離的方法有劃線分離法,稀釋分離法.

4、篩選：

這一步是採用與生產相近的培養基和培養條件,通過三角瓶的容

量進行小型發酵試驗,以求得適合於工業生產用菌種.

關於菌種的識別，細菌、放線菌、酵母菌和黴菌，每一類微生物在一定培養條件下形成的菌落各具有某些相對的特徵，利用觀察這些特徵，來區分各大類微生物及初步識別、鑑定微生物。

土壤

一般取土壤表層5-10cm處土壤，如果土壤有翻動，應更深一點，避免空氣中微生物污染。

1我們一般都用那種封口袋（塑料的），紙袋不容易保持水分。2當天採當天快遞回來，不用加冰袋。

3快遞一般三天就到，對微生物菌羣影響不大。

4在冰櫃中4度保存，時間不要超過一個月，儘量隨採隨做。菌株分離（seperation）就是將一個混雜着各種微生物的樣品通過分離技術區分開，並按照實際要求和菌株的特性採取迅速、準確、有效的方法對它們進行分離、篩選，進而得到所需的微生物的過程。

工業微生物產生菌的篩選一般包括兩大部分：一是從自然界分離所需要的菌株，二是把分離到的野生型菌株進一步純化並迸行代謝產物鑑別。

菌種可從以下幾個途徑進行收集和篩選：

（1）向菌種保藏機構和個人索取有關的菌株，從中篩選所需菌株。國內外著名的菌種保藏機構有：中國微生物菌種保藏管理委員會

（CCCCM），美國典型菌種保藏中心（ATTC），英國國家典型菌種保藏所（NCTC），日本的大阪發酵研究所（IFO）等。

（2）由自然界採集樣品，如土壤、水、動植物體等，從中進行分離篩選。

（3）從一些發酵製品中分離回的菌株，如從醬油中分離蛋白酶產生菌，從酒糟中分離澱粉酶或糖化酶的產生曲等。該類發酵製品經過長期的自然選樣，具有悠久的歷史，從這些傳統產品中容易篩選到理想的菌株。

菌株的分離和篩選一般可分為:採樣、富集、分離、產物鑑別、生化鑑定幾個步驟。

一、從土壤中採樣

1克土壤的含菌量大體有如下的遞減規律：細菌（108）＞放線菌（107）＞黴菌（106）＞酵母菌（105）＞藻類（104）＞原生動物（103）

（一）根據土壤特點

1．土壤有機質含量和通氣狀況

採土樣最好的上層是5-25cm、一般每克上中含菌數約幾十萬到幾十億個，並且各種類型的細菌和放線菌幾乎都能分離到。總的來説酵母菌分佈土層最淺，約5-10cm；黴菌和好氧芽孢桿菌也分佈在淺土層。

2．土壤的酸鹼度和植被狀況

3．地理條件：南方、北方

4．季節條件：7-10月

（二）採樣方法

用取樣鏟，將表層5cm左右的浮土除去，取5-25cm處的土樣10-25g，裝入事先準準備好的塑料袋內紮好、北方土壤乾燥．在10-30cm處取樣。給塑料袋編號並記錄地點、土壤土質、植被名稱、時間及其他環境條件。一般樣品取回後應馬上分離。以免微生物死亡。但有時樣品較多，或到外地取樣，路途遙遠，難以做到及時分離，則可採先用選擇性培養基做好試管斜面，隨身帶走。到一處將取好的土樣混勻，取3-4g撒到試管斜面上．這樣可避免菌株因不能及時分離而死亡。

二、根據微生物生理特點取樣

1．根據微生物的營養類型

每種微生物對碳、氮源的需求不一樣，分佈也有差異。若需要篩選代謝合成某種化合物的微生物，從大量使用、生產或處理這種化合物的工廠附近採集樣品，容易得到滿意的效果。不少微生物對碳源的利用是不完全專一的，如以油脂為碳源的某些脂肪酶產生菌同樣也可以分解澱粉獲得能源而生長。

2．跟據微生物的生理特性

三、特殊環境下采樣

1．局部環境條件的影響

2．極端環境條件的影響

　　土壤微生物篇二：土壤微生物的分離和純化

土壤微生物的分離和純化

一、實驗目的

1、掌握從土壤中分離、純化微生物的原理與方法。

2、學會根據微生物培養特徵初步判斷未知菌的類別。

3、練習微生物接種、移植和培養的基本技術，掌握無菌操作技術。

二、實驗原理

土壤是微生物生長和棲息的良好基地。土壤具有絕大多數微生物生活所需的

各種條件，是自然界微生物生長繁殖的良好基地。因此，土壤是微生物資源的巨

大寶庫。

牛肉膏蛋白腖培養基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養基，可用於

培養細菌。鏈黴素可以抑制細菌和放線菌的生長，對酵母菌和黴菌不起作用。

加入一定量鏈黴素的培養基可以從混雜的微生物羣體中分離出酵母菌和黴菌。重

鉻酸鉀或苯酚對土壤真菌、細菌有明顯的抑制作用，可用於選擇分離放線菌。

三、實驗器材

1、材料：10cm左右深層土壤。

2、培養基：牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基、馬丁氏培養基、高氏Ⅰ號培養基

3、其他物品：試管、三角瓶、燒杯、量筒、電子天平、精密pH試紙、培養皿、

高壓蒸汽滅菌鍋、移液槍、槍頭、接種環、酒精燈、鏈黴素(1萬單位/ml)、10%

苯酚、無菌水。

四、實驗步驟

1、土樣採集：取10cm左右深層土壤10g備用。

2、製備土壤稀釋液：稱取土壤1g，放入有99mL無菌水的三角瓶中，振盪均勻，

即為稀釋10－2的土壤懸液。然後進行十倍梯度稀釋，依次製備10－3、10－4、10

－5、10－6、10－7稀釋度的土壤稀釋液。

3、培養基平板製備：按培養基配方各配置牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基、馬丁氏培

養基、高氏Ⅰ號培養基各100ml。滅菌後分別倒3個平板。（高氏Ⅰ號培養基滅

菌前加入10滴10%苯酚；馬丁氏培養基倒平板前加入2ml去氧膽酸鈉(2%)和

0.4ml1萬單位/ml鏈黴素）

4、接種：用無菌吸管吸取0.1ml相應濃度土壤稀釋液，以無菌操作技術接種在

平板上，塗布均勻。細菌選用10－4、10－5、10－6三個稀釋度接種於牛肉膏蛋白腖

瓊脂培養基，放線菌與黴菌選用10－2、10－3、10－4三個稀釋度，分別接種於高

氏Ⅰ號培養基、馬丁氏培養基。（一個稀釋度一個平板）

5、培養：細菌平板於37℃恆温培養1～2d，放線菌於30℃培養2～3d，黴菌於

30℃培養3～5d，觀察。

6、計數：用稀釋水樣檢測平板的菌落計數方法進行計數，報告細菌總數

/(CFU·ml-1)

7、純化：挑取典型菌落接種於相應平板，培養條件同上，培養純化。

五、思考題

1、分離放線菌和真菌為什麼需要分別加重鉻酸鉀和鏈黴素？

2、怎麼檢驗培養皿上的某個單菌落是不是純培養？

　　土壤微生物篇三：土壤微生物

土壤微生物多樣性的`研究方法及進展

摘要：微生物是地球上生物多樣性最為豐富的資源,微生物資源的開發，是21世紀生命科學發展的主要動力之一。由於微生物的微觀性，微生物多樣性與其他高等生物相比有許多獨特之處。微生物多樣性的揭示與研究技術的發展和創新是密不可分的研究技術的進步是微生物多樣性研究向前發展的重要推動力量。近年來，隨着微電子、計算機、分子生，物學、物理、化學等技術的發展，微生物多樣性研究技術也在吸收其他學科先進技術的基礎上不斷向前發展。各種研究方法的發展使得這種狀況有了很大改觀。

關鍵詞：土壤微生物，多樣性，研究方法

土壤是微生物的大本營，微生物在土壤養分轉化與腐殖質形成過程中有着重要的作用。土壤中微生物多樣性受耕作方式、地理位置、土壤層次、植被、土壤肥力、氣候變化及土壤類型等諸多因素的影響。反之，土壤微生物的多樣性又影響土壤生態系統的結構、功能及過程，它是維持土壤生產力的重要組分。研究土壤微生物多樣性對於探索自然生命機制、應對全球氣候變化、治理各類環境污染、維持生態服務功能及促進土壤持續利用等方面具有重要意義。保持微生物的多樣性對於人類農業生產亦具有重要意義。土壤微生物多樣性概念土壤微生物是土壤中一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱，通常意義上應當包括古菌、細菌、放線菌、真菌、病毒、原生動物和顯微藻類等。土壤是微生物生長和繁殖的天然培養基。土壤微生物多樣性是指土壤生態系統中所有的微生物種類、它們擁有的基因以及這些微生物與環境之間相互作用的多樣化程度及生命體在遺傳、種類和生態系統層次上的變化。

1.土壤微生物研究的主要領域

由於土壤微生物數量巨大，種類繁多，遠遠超過人們已經描述的數量，這要求在研究土壤微生物多樣性，特別是探討其在土壤生態系統中的功能作用時，要有針對性，選擇恰當的研究領域。現在人們最廣泛研究的土壤生境或者稱為土壤生物區系的影響圈包括，如植物根際即有根植物的根區，主要有菌根菌、根瘤菌和其他有益於或者危害植物的微生物組成。

另外，我們所研究的土壤、濕地及各種沉積物生態系統是相互聯繫的統一體。對於一些特殊的界面如帶、土壤與水生生境、陸地與地下水之間的區域，在這些地帶，通常聚集着豐富的微生物和其他生物，它們促進並控制營養物質在相鄰生態系統間的轉移，這些地帶被稱為遷移控制帶。遷移控制帶中的微生物對於研究生態系統間的相互作用具有十分重要的意義。

2.土壤微生物多樣性的研究方法

一般而言,一個具有多樣性與活性的生物羣落的土壤一定具有較為豐富的土壤養分。更重要的是,土壤微生物羣落結構和組成的多樣性與均勻性不僅提高了土壤生態系統的穩定性和和諧性,同時也提高了對抗土壤微生態環境惡化的緩衝能力。目前土壤微生物多樣性已引起國內外學者的極大重視,對土壤微生物羣落結構的研究日益增多,研究的方法也在不斷的改進。

2.1傳統的微生物培養法

傳統的微生物培養法就是根據目標微生物選擇相應的培養基，然後通過各種微生物的生理生化特徵及外觀形態等方面進行分析鑑定。這種方法對於衡量小羣體多樣性方面不失為一種快速的方法。由於這種方法人為限定了一些培養條件，無法全面反映微生物生長的自然條件，常常造成某些微生物的富集生長。而另一些微生物缺失。另外，由於缺乏對微生物真正生存環境的認識，所以迄今為止,只有1%的土壤微生物能夠被培養，而大多數只能存在而無法被培養。因此傳統的研究方法只能反映極少。

2.2生物標記物法

由於以往的生物化學方法只是對微生物羣落的一些指標進行測量(如腺苷酸含量、呼吸放出的CO2量、熱放出量等)，所得數據也無法對微生物羣落結構進行分析。近20年來學者們潛心研究並確信了另一種可以可靠估價微生物生物量及羣落結構的方法-生物標記物法。目前用生物標誌物來定量描述土壤微生物羣落結構是較為常用的方法之一。這種生物標誌物通常是微生物細胞的生化組成成分，或是細胞外分泌的產物。常使用的生物標記物有磷脂酸、酯類多糖類A脂肪酸、磷脂類化合物中的脂肪酸及鞘脂類化合物等。應用這種方法時首先要選擇一種適宜的提取劑直接把其從土壤中提取出來，然後對提取物進行純化，再用合適的儀器加以定量測量。

應用磷脂類化合物的脂肪酸組成來研究微生物羣落結構是一種較新的方法,磷脂類化合物只存在於所有生物的細胞膜中,一旦生物細

胞死亡,其中的磷脂類化合物馬上消失。生物中的磷脂類化合物能顯示出快速的轉換率,而且生物可以把相對穩定的磷脂類化合物作為它們的生物量。磷脂類化合物的這些特徵和磷脂類化合物與生物的密切關係可以作為土壤微生物羣落指紋分析。

2.3核酸探針雜交技術

核酸分子雜交技術是20世紀70年代發展起來的一種分子生物學技術。該技術快速、靈敏、具有高度特異性，近年來被廣泛應用於微生物多樣性的研究中。用於微生物多樣性研究的探針主要有三類：雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA以及寡核苷酸探針。雜交方式主要有熒光原位雜交、全細胞雜交、數量印跡雜交及生物芯片。對於環境微生物樣品解析而言，最有意義的核酸雜交技術是原位雜交技術，在原位雜交技術中，應用最廣泛的是熒光原位雜交技術。

熒光原位雜交是新興的分子生物學技術，是在原有的放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性原位雜交技術，是目前原位雜交技術中最常用的方法之一。

2.4分子生物學方法

現代分子生物技術的發展使生物學的研究更加深入,並逐漸成為揭示生命科學規律的有利手段。自從1980年Torsvid第一次從土壤中提取細菌DNA以來,在土壤微生物羣落功能評價和方法研究上取得了很大進展。利用分子技術分析核酸使人們逐漸認識到微生物多樣性的複雜性。土壤微生物在基因水平上的多樣性可以通過微生物中的DNA組成的複雜性表現出來。這種方法首先要從土壤微生物體中有

效的提取DNA或RNA,經過純化後結合PCR擴增,分子克隆等分子生物技術進行分析。分子生物技術方法可以克服傳統培養法造成的信息大量丟失的缺點,能夠更全面更客觀的對樣品進行分析,更精確地揭示土壤微生物種類和遺傳多樣性。

3.土壤微生物多樣性研究展望

隨着人們對土壤微生物多樣性研究的不斷深入，今後的研究工作將集中在如下四個方面：(1)新技術新方法的應用。隨着分子生物學技術的發展，目前的新型技術如DNA芯片技術、環境全基因組測序技術和穩定同位素標記技術等，為土壤微生物多樣性研究提供了新的方法，從而能將微生物在基因層面上所發生的變異與環境因子相結合，為土壤微生物多樣性功能與生態系統平衡以及各功能羣落結構之間關係的研究提供有力的支持。(2)各種研究方法有機結合。目前對單一方法的研究已經基本成熟，今後有必要加強對各種研究方法的靈活應用，根據各種方法的優缺點將其有機結合，取長補短，消除單一方法的誤差，提供更加全面準確的微生物多樣性變化信息。(3)對土壤微生物功能多樣性和功能羣的研究。土壤微生物功能多樣性與土壤功能關係密切，土壤微生物功能多樣性是土壤功能的保證，同時也是恢復土壤功能的基礎。迄今為止，研究較多的功能多與C、N、S等元素的物質循環和污染物降解過程相關,其他生態過程(例如磷循環)的相關功能研究結果則很少。而微生物多樣性研究的一個明顯的趨勢是將微生物的功能多樣性提到了更為突出的位置,在物種尺度之上，更強調功能羣的劃分,圍繞某一土壤生態功能羣開展研究正成為土壤